HSP90在严重烧伤后肠上皮细胞缺氧性损害中的保护作用及机制研究

【摘要】烧伤、创伤、休克等应激性刺激均能够造成肠黏膜屏障功能的损害，肠黏膜屏障功能受损以后，大量微生物及内毒素可以通过门静脉和淋巴系统进入体循环，从而导致机体内微生物易位和内毒素血症，进而激发机体内的细胞因子以及其它炎症介质的连锁反应，最终导致全身多个器官出现功能障碍(MODS)。因此，人们普遍认为在应激情况下肠道是导致MODS的始动器官。肠道具有众多的十分重要的功能，结构及功能完整的肠黏膜屏障对于肠道功能的发挥具有无可替代的作用，因此，在机体出现应激时如何保护肠黏膜屏障的完整性，对于维护肠道的正常功能具有十分重要的意义。肠上皮细胞增殖与凋亡之间的动态平衡对于维持肠黏膜屏障的完整性至关重要，一旦这一平衡被打破，肠上皮细胞凋亡过度将致使肠黏膜屏障的完整性受损，肠道功能也终将出现障碍。根据文献报道，机体内缺氧可出现在严重的烧、创伤等应激情况下，热休克蛋白90(HSP90)，是体内十分重要的蛋白分子伴侣之一，参与了多种细胞信号转导以及细胞功能的调节，对于应激导致的细胞凋亡具有明确的保护作用。Akt激酶是磷酸肌醇依赖激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路中的关键蛋白分子，在抑制细胞凋亡、促进细胞存活等进程中具有重要的作用；HSP90可能是Akt激酶的重要调节分子之一，它们共同参与抑制细胞的凋亡。然而，目前的文献研究中，关于缺氧能否诱导肠上皮细胞凋亡、HSP90以及PI3K/Akt信号通路是否参与抑制缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡、及其分子机制均尚未得到十分明确阐述。综上所述，本课题将对上面提到的问题进行深入探讨。我们在前期的实验中构建了肠上皮细胞缺氧(1%O2)的模型，建立了过表达/低表达HSP90肠上皮细胞系。运用细胞增殖与活性(CCK-8)法检测各组细胞的活力、采用细胞流式和TUNEL染色技术检测细胞凋亡率，进一步观察了HSP90对于缺氧(1%O2)肠上皮细胞活力及凋亡的影响。实验结果显示：缺氧(1%O2)能够提高肠上皮细胞的凋亡率，缺氧时间延长至12h时肠上皮细胞凋亡率最为显著，并且缺氧时间与细胞凋亡率呈正比关系；随着缺氧时间的延长，细胞活力也逐渐下降；在缺氧12h这一时间点，与正常肠上皮细胞组相比，过表达HSP90的肠上皮细胞组的细胞凋亡率明显下降；与此相反，低表达HSP90的肠上皮细胞组的细胞凋亡率显著增高。这一实验结果表明，HSP90可以抑制缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡，对于细胞的凋亡损害具有重要的保护作用。接着，我们采用多种不同的信号激酶抑制剂作用各组肠上皮细胞，运用流式细胞技术检测各组缺氧细胞的凋亡率，探讨哪一条或几条信号传导通路在缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡中发挥主要作用。实验结果证实，缺氧(1%O2)12h后，与其他抑制剂细胞组相比较，LY294002，作为Akt激酶特异性阻断剂，处理后的肠上皮细胞组凋亡率最为显著；LY294002作用过表达HSP90肠上皮细胞后，与单纯的过表达组细胞相比，LY294002组细胞凋亡率显著增高，这一结果证实：Akt信号通路在HSP90保护缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡损害这一进程中具有举足轻重的作用。前期的研究我们已经证实HSP90和Akt信号通路参与抑制缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡，但是，其具体的分子机制是什么，在Akt信号通路中，哪些主要蛋白质分子在这一过程中发挥了关键的作用呢？接着，我们采用WB蛋白免疫印迹技术，检测了在正常和缺氧(1%O2)情况下肠上皮细胞Akt通路中的多种相关效应分子Akt、PI3K、PDK1、Bcl-2蛋白，以及BAD、细胞色素c(cytochromec)、caspase3、PARP的蛋白质表达。实验结果显示：与正常细胞组相比，缺氧处理12h后，Akt激酶活性的增高；与单纯缺氧细胞组相比，过表达HSP90肠上皮细胞组磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达水平进一步升高；反之，低表达HSP90肠上皮细胞组p-Akt蛋白表达水平明显降低；但是，Akt上游的PI3K,、PDK1分子蛋白无明显变化。从而提示，机体缺氧仅能够激活Akt信号通路中的Akt蛋白激酶；在缺氧肠上皮细胞中，HSP90能够增强Akt的磷酸化，维持Akt激酶的活性，而HSP90增强Akt磷酸化的作用并不是通过PI3K、PDK1来实现的。BAD和cytochromec是线粒体凋亡通路中的两个重要蛋白分子，在调控细胞凋亡进程中作用显著。我们的实验结果表明，与正常对照细胞组相比，缺氧处理细胞12h后，磷酸化BAD(p-BAD)蛋白水平表达升高，cytochromec表达亦升高；与单纯缺氧12h细胞组相比，过表达HSP90肠上皮细胞组磷酸化p-BAD蛋白质水平显著升高，而cytochromec表达降低；与此结果相反，低表达HSP90肠上皮细胞组p-BAD水平显著下低，而cytochromec表达水平显著升高。结果证实，HSP90能够提高p-BAD蛋白表达，降低cytochromec蛋白表达。caspase3和PARP是细胞凋亡的重要执行分子，和正常对照组相比，在缺氧处理细胞12h后上述两个蛋白分子表达升高，在过表达HSP90肠上皮细胞组中，两者表达均显著降低；与此相反，在低表达HSP90肠上皮细胞组中，两者活性均显著升高，进而从分子层面阐明了HSP90能够抑制缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡损害。那么，HSP90与p-Akt之间是否具有相互作用呢？实验采用免疫荧光共定位技术，观察了HSP90与磷酸化Akt的相互作用，免疫荧光共定位观察到两者在细胞内的共定位情况；采用免疫共沉淀技术，结果表明，与对照组相比较，过表达HSP90肠上皮细胞组p-Akt水平显著增高，而低表达HSP90肠上皮细胞组p-Akt水平明显下低，证实了HSP90与p-Akt之间相互作用。在动物实验中，建立严重烧伤后小鼠模型，证明HSP90能够显著减轻严重烧伤后小鼠肠黏膜的损害程度，对小鼠肠黏膜完整性具有十分良好的保护作用。综上所述，严重烧、创伤后机体缺氧能够诱导肠上皮细胞凋亡，破坏肠黏膜的完整性；体外与体内实验中，我们证实了HSP90能够抑制缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡，减轻肠黏膜屏障损害程度。其机制主要是HSP90通过与Akt之间相互作用，增强p-Akt蛋白表达，维持其活性，Akt进而激活p-BAD、减少cytochromec从线粒体内释放至细胞质，进而抑制肠上皮细胞细胞凋亡caspase级联反应。HSP90为严重烧、创伤后缺氧导致的肠上皮细胞凋亡损害的预防和治疗提供了一个潜在的、有效的基因治疗靶点。
【作者】张帅；
【导师】彭毅志；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学，2014，博士
【关键词】烧伤；热休克蛋白90；肠上皮细胞；缺氧；细胞凋亡；PI3K/Akt信号通路；

【参考文献】
[1]刘建国.论抗战时期国民政府的难民救助[D].河南大学,中国近现代史,2004,硕士.
[2]门奕娇.高血压病患者脉压、动态脉压与左房内径的相关性分析[D].河北医科大学,内科学,2013,硕士.
[3]王晓璐.基于C8051F数据采集传输平台的研究与实现[D].东北大学,计算机应用技术,2010,硕士.
[4]李朝霞.有限群与两类关联结构[D].杭州电子科技大学,基础数学,2012,硕士.
[5]张霖斌,姚振兴,纪晨,张中杰.快速模拟退火算法及应用[J].石油地球物理勘探,1997,05:654-660+750.
[6]凌家艳.妇人血虚证的病因学探讨与临床研究[D].湖北中医学院,中医妇科学,2004,硕士.
[7]冯俊生,许晓锋,赵丽华.纳米复合脱氮剂/气动超声吹脱高浓度氨氮废水[J].环境工程学报,2015,01:177-182.
[8]廖彩源,徐章云,孙肖明.变电站微型机巡检及短路瞬态电流的检测[J].冶金自动化,1984,06:35-38.
[9]张英俊.用Agent连接件提高软件体系结构适应性研究[D].太原理工大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[10]张沙.基于VIE模式海外上市互联网企业风险研究[D].沈阳航空航天大学,企业管理,2013,硕士.
[11]迟毓凯.人格与情境启动对亲社会行为的影响[D].华东师范大学,2005.
[12]叶帆.女性油画家意象表现形式比较研究[D].赣南师范学院,美术学,2014,硕士.
[13]张婧.几种合金钢的表面纳米化和渗氮行为研究[D].东北大学,材料学,2011,硕士.
[14]刘少南.初始温度对煤自燃特征影响的实验研究[D].西安科技大学,安全技术及工程,2014,硕士.
[15]何轲.超短基线阵在水雷目标探测与定位上的应用研究[D].西北工业大学,检测技术与自动化装置,2004,硕士.
[16]贾蕊.活血化瘀通络方对糖尿病肾病大鼠的保护作用及对血管紧张素Ⅱ1型受体的影响实验研究[D].河北医科大学,中西医结合临床,2013,硕士.
[17]罗遥凌.电脉冲用于水泥基材料TSA加速研究[D].重庆大学,材料工程（专业学位）,2014,硕士.
[18]王一波.基于ACF的软结构生物反应器设计及对高浓度有机废水的处理效果[D].安徽工程大学,环境工程,2012,硕士.
[19]杨洋.基于人工神经网络的煤化工项目风险评价研究[D].中北大学,技术经济及管理,2014,硕士.
[20]刘佳仕.商业贿赂犯罪的立法思考[D].湖南师范大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[21]许少华,何新贵,王兵.一种时变输入输出过程神经元网络及学习算法研究[J].控制与决策,2007,12:1425-1428.
[22]高文英.管束干燥机管束装置的强度分析[D].东北大学,机械设计及理论,2009,硕士.
[23]毕含峰.医院药品管理信息系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[24]夏亚明.武汉兴业银行发展战略研究[D].华中科技大学,工商管理,2013,硕士.
[25]李洁,王贵欣,闫康平.锂离子混合超级电容器研究进展[J].电子元件与材料,2011,08:83-86.
[26]王婧.MOSFET的强电磁脉冲损伤效应研究[D].西安电子科技大学,微电子学与固体电子学,2012,硕士.
[27]胡恺君,吴锡生,王士同.核化的自联想反馈神经网络[J].控制与决策,2005,11:37-42.
[28]韩莹石.我国劳动合同解除制度之法律研究[D].甘肃政法学院,经济法学,2012,硕士.
[29]董洋.基于图像处理的光照不均铁路扣件状态检测[D].西南交通大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[30]绳欢.科技特派员制度长效运行机制研究[D].江西农业大学,农业科技组织与服务,2012,硕士.
[31]谢明.基于IEC61968的电业局营销业扩报装信息化系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[32]于宝池,张志礼.基于矿产资源丰度系数征收资源税的方法[J].有色金属(矿山部分).2001(06)
[33]覃婷婷.农村高中数学教师对新教材适应性的个案研究[D].西南大学,课程与教学论,2014,硕士.
[34]韩秋萍.水稻土条件的旋耕机性能测试及小麦响应研究[D].南京农业大学,农业机械化工程,2011,硕士.
[35]王鑫国.电力系统短路试验台控制系统研究与开发[D].河海大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[36]吴华,王利杰,孙希鹏,黄森鹏,孙信华,于茫,陆东梅.碳化硅表面高温改性法热场模拟研究[J].科技创新导报,2012,01:14-16.
[37]邓乃梅.医院高危科室院内感染的影响因素及干预研究[D].山东大学,公共卫生（专业学位）,2012,硕士.
[38]马衍东.分子纳米链和二维材料的电子结构及相关性质的第一性原理研究[D].山东大学,2014.
[39]张伟伟,钟华寿,肖华,叶正寅.颤振飞行试验的边界预测方法回顾与展望[J].航空学报.
[40]曹千芊.同步单频蜂窝系统——理论分析与系统仿真研究[D].浙江大学,通信与信息系统,2004,硕士.
[41]曾昭鉴.稻田养鱼[J].新农业.1989(06)
[42]徐晓东.设备状态监测无线集成网络研究及工业应用开发[D].广东工业大学,机械电子工程,2004,硕士.
[43]张端秀.婴儿痉挛症中医证型分布特点及与脑电图、预后的关系研究[D].遵义医学院,儿科学（专业型学位）,2012,硕士.
[44]王淼.磷酸肌酸对冷保存的离体大鼠肝脏保护作用的实验研究[D].河北医科大学,外科学,2013,硕士.
[45]赵庆丽.GPRS信息家电控制信息传输系统的研究[D].大连理工大学,通信与信息系统,2004,硕士.
[46]缪君,储珺,张桂梅,王璐.基于稀疏点云的多平面场景稠密重建[J].自动化学报,2015,04:813-822.
[47]汪洪.钯纳米线负载金对乙醇氧化协同效应的研究[D].华南理工大学,应用化学,2012,硕士.
[48]王斌.非理想信道下MIMO干扰对准技术研究[D].苏州大学,电子与通信工程（专业学位）,2014,硕士.
[49]封士成.硫酸镁对人脐静脉血管内皮细胞放射损伤的防护作用[D].苏州大学,放射医学,2014,硕士.
[50]孙莹莹.论民事纠纷的行政调解制度完善[D].吉林大学,法律,2014,硕士.